В препарате раздавленная капля выявляют. Фаготипирование бактерий
РАЗДАВЛЕННАЯ КАПЛЯ - метод приготовления препаратов для микроскопического исследования биологических объектов. В исследовательской практике Р. к. используют при изучении формы, размера и расположения микроорганизмов, выявления подвижности бактерий, при наблюдении за ростом и размножением микроорганизмов, для изучения реакций микроорганизмов на хим. соединения (хемотаксис) и физические факторы. В практике мед. микробиологии этот метод применяют при микроскопическом исследовании материала от больных для обнаружения возбудителей заболеваний, обладающих специфической морфологией,- простейших, спирохет, грибков. Методом Р. к. и его модификациями пользуются также при микроскопическом исследовании кала и других выделений на яйца и личинки гельминтов.
Для приготовления препарата готовят взвесь исследуемого материала в изотоническом р-ре хлорида натрия или водопроводной воде, добавляя вещества, облегчающие процесс микроскопии (красители, осветлители и др.); используют также культуры микроорганизмов на жидких или полужидких питательных средах, биол, жидкости. Каплю материала помещают на предметное стекло и сверху кладут покровное стекло, избегая появления в препарате пузырьков воздуха. Жидкость не должна выступать за пределы покровного стекла. Щель между предметным и покровным стеклами может быть герметизирована вазелином или смесью, состоящей из равных объемов вазелина и парафина. При исследовании быстродвижущихся микроорганизмов, чтобы уменьшить скорость их движения к суспензии можно добавить метилцеллюлозу. В этом случае можно наблюдать движения жгутиков. При микроскопии живых клеток возможно использование прижизненных (витальных) красителей - метиленового синего, нейтрального красного и других (в разведении 1:1000 - 1:10 000), повышающих контрастность препаратов и позволяющих выявить внутреннее строение простейших, грибков и др.
В зависимости от объекта и целей изучения микроскопию можно проводить при малом или большом увеличении с сухой или иммерсионной системами. В простейшем случае микроскопию осуществляют в затемненном поле зрения при суженной диафрагме и опущенном конденсоре. Более четкое изображение дают микроскопия в темном поле зрения, фазово-контрастная или аноптральная микроскопия (см. Микроскопические методы исследования). При приготовлении препаратов толщина предметных стекол не должна превышать 1,2 мм, а толщина покровных стекол - 0,17 мм. Предметные и покровные стекла должны быть чистыми и обезжиренными. При микроскопии в темном поле зрения препарат готовят как можно тоньше, а толщина покровных стекол не должна превышать 0,11 мм.
С. С. Белокрысенко.
На предметное стекло наносят пипеткой или петлей каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. ! Чтобы не образовалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его
Для предохранения от высыхания препарат помещают во влажную камеру
Микроскопируют в темном поле при увеличении объектива 40Х
Препарат можно поместить во влажную камеру для предохранения от высыхания
Метод висячей капли
Микроскопия сначала при увеличении 8Х. Находят край капли, а затем переводят на большое увеличение 40Х (рис. № 11).
Рис. №10 . Техника приготовления препарата висячая капля
Рис.
№11
.
Лептоспира в темном поле
ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №6
Зачетное занятие с замером навыков по теме:
«Морфология микроорганизмов»
Перечень манипуляций к зачету:
Подготовить препарат и окрасить его по методу Грама. Значение метода
Подготовить препарат и окрасить его по методу Ожешко. Значение метода
Подготовить препарат и окрасить его по методу Бурри-Гинса. Значение метода
Подготовить препарат, окрасив его по методу Циля-Нильсена (1999г). Значение метода
Подготовить препарат висячая капля, значение методики
Подготовить препарат раздавленная капля, значение методики
Промикроскопировать готовые препараты, окрашенные различными методами: по Граму, Ожешко, Бурри-Гинсу, Циля-Нильсену.
Вопросы к зачету:
Назовите основные формы бактериальных клеток,
Перечислите основные и дополнительные структуры прокариотической клетки, их функции,
Укажите состав и строение жгутиков, группы бактерий по расположению жгутиков,
Назовите строение и функции нуклеоида у прокариот,
Укажите, что собой представляет спора и ее значение для бактерий, расположение спор в клетке (примеры микробов).
Тестовые задания для самоконтроля
1. Расставьте этапы приготовления препарата в нужном порядке:
а) окрашивание
б) фиксация
в) приготовление мазка
г) высушивание
2. Укажите соответствие между возбудителем и методом его окраски:
стафилококк а) по Граму
микобактерия туберкулеза б) Циля - Нильсену
пневмококк в) Бурри - Гинсу
бацилла сибирской язвы г) Ожешко
3. Простой метод окраски:
а) по Нейссеру
б) метиленовым синим
в) по Граму
г) по Романовскому - Гимзе
4. Хранителем наследственной информации у прокариот является:
а) нуклеоид
в) включения
г) капсула
5. Окраска по методу Бурри отличается от метода Бурри-Гинса:
а) по времени окрашивания
б) отсутствия фуксина Пфейффера
в) разные разведения туши
г) мазок фиксируется в пламени горелки
6. При окраске препарата методом Циля-Нильсена (инструкция 1999г.) используется:
в) 5% Н 2 SО 4
г) 25% Н 2 SО 4
7. К спорообразованию способны:
а) стафилококки
б) бациллы
в) сарцины
г) кишечная палочка
8. В методике окраски по Бурри-Гинсу используется черная тушь, разведенная в
9. Укажите соответствие:
Метод окраски: Цель метода:
метод Ожешко а) обнаружение капсулы
метод Бурри б) определение кислотоустойчивости
метод Циля-Нильсена в) отношение к Граму
4. метод Грама г) определение споры
10. При изучении подвижности используется микроскопия: а) фазово-контрастная
б) темнопольная
в) электронная
г) люминисцентная
11. Гонококки - это шаровидные бактерии, в мазках выглядят как:
а) диплококки
б) сарцины
в) микрококки
г) тетракокки
12. При окраске по Граму используется следующий краситель:
а) фуксин Циля
б) метиленовый синий
в) бриллиантовый зеленый
г) генциановый фиолетовый
13. Спору у бактерий можно выявить, окрасив препарат:
а) метиленовым синим
б) методом Ожешко
в) методом Грама
г) по Бурри-Гинсу
14. Флагеллин - это белок, входящий в состав:
а) оболочки
б) капсулы
в) цитоплазмы
г) жгутиков
15. Укажите соответствие:
Вид микроскопии: Цель применения:
1) Световая обычная микроскопия а) для изучения живых неокрашенных
препаратов
2)Фазово-контрастная микроскопия б) для изучения окрашенных препаратов
16. Перетрихи - имеют следующее расположение жгутиков на клетке:
а) по всей поверхности
б) на обоих концах
в) пучок на одном из концов
г) один жгутик на конце клетки
17. Виды фиксации:
1) физический а) пламя горелки, б) смесь Никифорова,
2) химический в) ацетон, г) спирт
18. Предметное стекло с лункой используется:
а) в методе Циля-Нильсена
б) изучение подвижности
в) изучения на наличие капсулы
г) при обнаружении споры
19. Дополнительной структурой бактерий является:
а) нуклеоид
в) капсула
г) рибосомы
20. Препарат из нативного материала готовится при окраске:
б) Бурри - Гинса
в) Ожешко
г) Циля-Нильсена
21. Бактерии штопорообразной формы называют:
а) спирохеты
б) спириллы
в) вибрионы
г) бруцеллы
22. Негативные методы окраски используются при методе:
а) Бурри-Гинса
б) Циля-Нильсена
г) Ожешко
д) Нейссера
23. В состав клеточной стенки бактерий входит:
а) крахмал
б) муреин
в) альбумин
24. Методы изучения микроорганизмов:
а) серологические
б) бактериологические
в) аллергические
г) все ответы верны
ОТВЕТЫ НА ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ
2 – б, в, г
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Алешукина А.В. Медицинская микробиология: Учебное пособие. – Ростов н/Д: Феникс, 2003 г.
Бакулина Н.А., Краева Э.Л. Микробиология. М., «Медицина», 1976
Микробиология /Под ред. Ф.К. Черкес. – М.: Медицина, 1986 г.
Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии: Учебник / А.А.Воробьев, Ю.С. Кривошеин, А.С. Быков и др. Под ред. А.А. Воробьева и Ю.С. Кривошеина. – М.: Мастерство; Высшая школа, 2001 г.
Прозоркина Н.В., Рубашкина Л.В. Основы микробиологии, вирусологии, иммунологии: Учебное пособие для средних специальных медицинских учебных заведений. – Ростов н/Д: Феникс, 2002 г.
Руководство для малого практикума по микробиологии, П.А.Чиров, З.И.Остроухова, Е.И.Тихомирова, Изд-во СГУ, 1998 г.
Сбойчаков В.Б. Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований: учебник для средних медицинских учебных заведений / В.Б. Сбойчаков. – СПб.: СпецЛит, 2007г.
ПРИЛОЖЕНИЕ №1
Техника безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии
Правила работы со спиртовкой
Заправленную спиртовку хранят плотно закрытой притертым колпачком, чтобы предотвратить испарение спирта с фитиля
При зажигании спиртовки нужно снять колпачок и поджечь фитиль спичкой. При этом нельзя сдвигать держатель фитиля, т.к. пламя проскочит внутрь спиртовки, что вызовет сильную вспышку и разбрызгивание горящего спирта
Нельзя зажигать спиртовку от другой уже горящей спиртовки, т.к. при этом может сдвинуться держатель фитиля и вылиться спирт
Нельзя дуть на пламя, чтобы погасить спиртовку. Для этого следует аккуратно закрыть спиртовку колпачком.
Необходимо следить за тем, чтобы спиртовка не перегревалась. Это ведет к испарению спирта и опасности взрыва
При длительном нагревании лучше пользоваться двумя спиртовками
Не следует при работе наклонять голову над спиртовкой, т.к. при накоплении паров спирта под держателем фитиля может происходить самопроизвольное вспыхивание
Правила пользования ручным химическим пенным огнетушителем
ОХП -10
В случае возникновения пожара необходимо:
Для приведения огнетушителя в действие – ручку верхней части корпуса поворачивают на 180 о и переворачивают огнетушитель вверх дном
Струю пены следует направлять не в центр пламени, а под минимальным углом к поверхности горения в нижнюю часть пламени, последовательно сбивая и оттесняя его от краев к центру
При тушении огня ОХП – 10 необходимо обесточить все помещения с помощью рубильника, т.к. химическая пена в составе огнетушителя обладает высокой электропроводностью
ОХП – 10 применяют для тушения крупных очагов возгорания, когда другие средства малоэффективны
Правила работы с живой культурой
Правила работы с нагревательными приборами
При работе с электроплитками склянки с огнеопасными жидкостями следует держать на расстоянии не менее 1 м от рабочего места
Работать на неисправном и незаземленном оборудовании категорически запрещается
При временном прекращении работы, даже на непродолжительное время, источники нагревания выключать
Нельзя нагревать толстостенную стеклянную посуду, мерную посуду, неградуированные цилиндры. Фарфоровую посуду (стаканы, выпарительные чашки) можно нагревать на открытом пламени или водяной бане
Стеклянную посуду с плоским дном нагревать на открытом пламени или электроплитке с открытой спиралью нельзя
ПРИЛОЖЕНИЕ №2
Правила работы в микробиологической лаборатории
Работа с заразным материалом требует особой тщательности и соблюдения правил личной и общественной безопасности при ее выполнении
В помещении лаборатории необходимо строго соблюдать чистоту и порядок. На рабочем столе не должно быть никаких посторонних предметов. Запрещается прием пищи, излишние разговоры, суета
Работа обязательно проводится в халате, шапочке, сменной обуви
Каждый студент имеет в лаборатории свое постоянное рабочее место
Материал для работы принимает дежурный по бригаде у лаборанта и раздает студентам в присутствии преподавателя
В начале занятия необходимо записать в тетрадь дату, номер, тему занятия, план выполняемой работы. В процессе работы делаются записи и зарисовки в дневник
Все предметы, использованные при работе с живой культурой, обезвреживаются
В конце занятия студенты сдают весь материал дежурному по бригаде, а он лаборанту или преподавателю
В конце занятия студент должен:
Привести в порядок свое рабочее место
Сдать микроскоп, материал дежурному
Вымыть руки дез. раствором, а затем мылом
Представить преподавателю для подписи дневник
Анна Вадимовна Палиенко
Руководство для студентов отделения 060110 «Лабораторная диагностика»
к практическим занятиям
по курсу «Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований»
раздел «Морфология микроорганизмов»
Приготовление прижизненных (нативных) препаратов.
Культуры для приготовления препарата.
Материалы для исследования и техника взятия
Вопросы для рассмотрения
1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под редакцией Егорова Н.С. МГУ, М. 1995г. Стр. 81-97, 20-28.
2. Коротяев А.И., Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. «Спец. литература». Санкт-Петербург, 1998. Стр. 14-18.
3. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. «Колос», М. 1972. Стр. 5-23.
ТЕМА: Приготовление микроскопических препаратов и их окраска.
1. Приготовление прижизненных (нативных) препаратов.
2. Приготовление мазков и их фиксация.
3. Красители, используемые в микробиологии.
4. Простые и сложные методы окраски.
Задание для выполнения лабораторной работы
1. Приготовить фиксированный препарат из молодой культуры дрожжей, окрасить его в течение 2-3 мин метиленовым синим и микроскопировать без иммерсии.
2. Приготовить фиксированный препарат из почвенной суспензии, окрасить по методу Грама, микроскопировать его и зарисовать.
3. Выполнить схематическое изображение клеточной стенки грамотрицательных и грамположительных прокариот.
Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей, обоженной в пламени спиртовки или стерильной пипеткой.
Пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель в правую. Правой рукой вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают в пламени спиртовки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность стекла, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и ватную пробирку и закрывают пробирку. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пламени спиртовки.
Для исследования живых клеток микроорганизмов применяют методы «раздавленной и висячей капли». В обоих случаях возможно окрашивание объекта “прижизненными” красителями – “витальная” окраска.
На чистое предметное стекло наносят каплю воды. В каплю вносят культуру и смешивают с водой. Накрывают каплю покровным стеклом так, чтобы не образовались пузырьки воздуха. Стеклянной палочкой прижимают покровное стекло к предметному. Капля должна быть небольшой, не выходящей за края покровного стекла, но если суспензия попала за край - удаляют фильтровальной бумагой. Микроскопируют препарат с объективом 40Х. Метод удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а также просмотра крупных объектов - плесневых грибов, дрожжей. Применяют при изучении запасных веществ клетки. Метод “висячей” капли – используются для длительных наблюдений за клетками микроорганизмов. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь её дна или края. Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8Х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают иммерсионный объектив.
Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микроорганизмов вносят в каплю раствора метиленового синего или нейтрального красного в концентрациях от 0,001 до 0,00001%. Затем готовят препарат по одному из выше указанных методов и микроскопируют. После микроскопии препараты, «раздавленной» или «висячей» капли опускают в дезинфицирующий раствор.
Метод раздавленной капли
Применяется при исследовании морфологии и подвижности микроорганизмов.
Каплю микробной суспензии помещают на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла. При работе с культурой, выросшей на твердой среде, на предметное стекло наносят каплю водопроводной воды, затем стерильной пипеткой берут небольшое количество культуры и перемешивают ее в капле. Покрывное стекло помещают ребром на предметное и осторожно помещают его на суспензию, следя за тем, чтобы между стеклами не было пузырьков воздуха. Избыток жидкости удаляют полоской фильтровальной бумаги.
Определение липолитической активности
Липолитические свойства культуры исследуют на среде определённого состава (бульон Штерна). Готовят бульон следующим образом: к 100 см 3 МПБ добавляют 1 см 3 глицерина и приливают 2см 3 свежеприготовленного 10 %-ного водного раствора сульфита натрия, затем по каплям 10 %-й спиртовой раствор основного фуксина (? 5 кап.).
Культуры культивируют в термостате при 37 0 С. Отмечают изменение цвета среды, рН (лакмусовой бумагой), помутнение, наличие хлопков.
Приготовление бактериальной суспензии
Стерильную жидкую синтетическую среду разливают в стерилизованные конические колбы по 100 см 3 .
Для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, делают посев на скошенный агар.
Подготовленные таким образом культуры инкубируют в термостате 24 ч при температуре (375)С, по окончании чего в пробирки с микроорганизмами вводят 5 см 3 соответствующей жидкой синтетической среды, осуществляя процесс механического воздействия. Приготовленную таким образом бактериальную суспензию вносят в колбы, содержащие по 100 см 3 соответствующей жидкой синтетической среды.
Культивирование микроорганизмов проводят в термостате при температуре 385С, с переменным механическим воздействием, осуществляемом на Shaker Type, с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 1 ч в сутки.
Определение общего количества микроорганизмов (КОЕ)
Сущность метода заключается в определении в 1 см 3 воды общего содержания мезофильных аэробов и факультативных анаэробов при культивировании на синтетической питательной среде при температуре 40 С в течении 24 часов. Определение начинают с приготовления разведений. Для этого в несколько пробирок наливают 10 см 3 стерильной воды. В первую пробирку стерильной пипеткой добавляют 1 см 3 исследуемой воды. Новой стерильной пипеткой вносят пробу в пробирку со стерильной водой, после чего этой же пипеткой набирают 1 см 3 из приготовленного разведения и переносят во вторую, из второй в третью и т. д. Из каждой пробы делают посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. По истечении 24 часов при температуре 40 С подсчитывают число выросших колоний. Если выросло большое количество колоний, то дно чашки делят на секторы и подсчет ведут в каждом отдельном секторе. Результаты подсчета выражают в количестве бактерий на 1 см 3 анализируемой воды с учетом посеянного объема.
Микроскопические одноклеточные организмы, называемые «микробы», а также некоторые бактерии, например, колиформные (формой напоминающие палочки) в огромном количестве содержатся в воде, особенно если она из природных источников - заросший и илистый пруд, ручей, лужа, речные заводи. Рассмотрим, как приготовить препарат «раздавленная капля», данный опыт считается простым и подходит в качестве начального обучения ребенка или начинающего биолога азам микроскопирования.
Препаратом называется подготовленная специальным образом для детального исследования на микроскопе биологическая ткань, микроорганизмы, субстрат. Изучение осуществляется на клеточном уровне, при этом функционирование органов или органоидов может быть остановлено действиями исследователя с применением фиксаторов. Неотъемлемой составной частью микропрепарата являются предметные и покровные стекла, между которыми он заключается для придания биоткани максимального плоского состояния, повышающего эффективность фокусировки на большом увеличении. Склеиваются стеклянные поверхности при помощи капли воды или бесцветной прозрачной пихтовой смолы. Пузырьки воздуха удаляются, края склейки протираются промокашкой. Если микропрепарат приготовлен для временного использования, стеклышки подлежат тщательной промывке, а отработанный образец уничтожению.
Последовательность, необходимая для приготовления препарата раздавленная капля , а также используемые инструменты:
Регистрация результатов наблюдения может происходить глазами или путем фотографирования. Для этого понадобится цифровая камера-окуляр, вставляющаяся вместо обычного в окулярную трубку и подключающаяся к компьютеру через последовательный порт USB. В этом случае картинка будет транслироваться на мониторе, пользователю будут доступны функции измерения размеров и углов, графическая обработка и фотосъемка.
Микромир, невидимый невооруженным зрением, способен впечатлить взрослых и детей, проявляющих интерес к науке. Микроскопия для многих становится не только элементом общеобразовательного процесса, но и увлекательным хобби. На что еще можно посмотреть в микроскоп, как делать микропрепараты с насекомыми, клетками лука, тонкими растительными срезами - вы можете прочитать в познавательных статьях и обзорах в тематическом блоге (раздел «Интересно»). Свои вопросы рекомендуем присылать в обратной связи или по электронной почте.
